代谢与跑轮|长期高脂饮食和运动对小鼠早期骨关节炎表型的不同影响

肥胖通过代谢、炎症和生物力学因素增加膝关节骨性关节炎（OA）的风险。OA的发生受代谢综合症的影响。了解这些系统性代谢条件（如过度肥胖、胰岛素抵抗、高血压和血脂异常），有助于了解OA的发病机制和对该疾病治疗的研究。

Timothy M. Griffin，Albert Batushansky ，Joanna Hudson，Erika Barboza Prado Lopes等研究了上述相关课题，即：慢性饮食诱导的肥胖后自主跑步运动对小鼠膝关节OA相关软骨和骨病理的影响。他们使用基于相关性的网络分析来确定不同饮食组和运动组中与早期膝关节骨性关节炎表型相关的系统和局部因素，并将研究过程和结论发表在了“Correlation network analysis shows divergent effects of a long-term, high-fat diet and exercise on early stage osteoarthritis phenotypes in mice"中。（原文地址： Journal of Sport and Health Science 9 (2020)119-131）。

首先他们将每组各20只雄性C57BL/6J小鼠在6至37周龄时分别喂食(10%千卡脂肪）（对照组）和高脂肪（HF）(60%千卡脂肪）饮食。这些小鼠饲养（每笼≤5只）在环境温度22˚C±3˚C，14/10小时的光/暗循环和通风的笼子中，他们可以自由获得食物和水。第25周后，每组的一半老鼠被关在带有跑轮的笼子里，连续12周采集运动活动相关的数据，并且期间根据实验方案不定时对实验小鼠进行体重和其他生化分析，采用组织学、显微计算机断层扫描和磁共振成像来评估关节组织结构和骨关节炎病理的变化。然后，使用基于相关性的网络分析，将这些局部变量与全身代谢（体重、体脂和葡萄糖耐量）、炎症（血清脂肪因子和炎症介质）和功能（机械触觉敏感性和握力）结果进行比较，采用双向方差分析来评估饮食和运动的影响。

1.全身代谢结果和IFP(infrapatellar fat Pad）

在实验开始9周后，即在小鼠15周龄时开始跟踪小鼠的体重(图1A)。结果发现HF喂养的小鼠体重多于对照组小鼠（p < 0.001）15%。在整个实验期间，这种差异在37周末时增加到62%（p<0.001）。在25周开始，被分配到运动组的动物被安置在跑步轮后，运动小鼠体重会偶尔地略有下降，HF喂养的不跑步小鼠的体重增加，但并没有改变它们在1、5或10周后测量的平均每日轮跑距离(图1A)。同时与第1周或第5周相比，两种饮食中的动物在第10周都跑得更少。到研究的最后阶段发现，HF饮食导致体重和体脂显著增加，但运动并没有改变任何结果(图1A)。运动前，HF饮食导致空腹血糖和葡萄糖耐受不良显著增加，这表明GTT期间获得的葡萄糖AUC>增加了2倍(图1B）。到36周时，对照组不运动小鼠的空腹血糖和GTT AUC值升高,这降低了与不运动HF动物的差异。相比之下，36周运动对照动物的葡萄糖值与24周的值保持相似，这与运动HF动物有显著差异(图1B)。此外他们还评估了由饮食和运动导致的IFP的大小变化。在24周时，当HF喂养的小鼠IFP的大小显著增加(图1C)，到36周时这种饮食效应消失。运动和不运动小鼠从24周到36周的IFP体积变化见(图1C)，可见运动并没有改变胶原蛋白的含量(图1C)。

2.血清脂肪因子和炎症介质

在研究的最后阶段，他们通过测量血清脂肪因子、炎症介质、组织修复和生长因子，进一步评估了炎症和代谢调节的系统标志物(图2)。HF饮食导致瘦素显著增加（>10倍，p < 0.0001），而运动没有改变,脂联素均未被饮食或运动所改变，IL-6升高的趋势也不显著(p = 0.12)(图2),VCAM1 IL-6升高的趋势也不显著（p = 0.12)。在不运动的HF饮食喂养的小鼠中，TIMP-1和IGF-1均升高（p < 0.001）。

Fig. 2. Effect of HF diet and exercise on serum adipokines, inflammatory mediators, and growth and repair factors. Serum biomarkers were measured in a subset of animals (n = 6/group) at the study endpoint by Luminex and ELISA-based assays. IL-1b, tumor necrosis factor a, and CCL2 were largely below the level of detection and therefore are not shown. HF diet effects were observed for leptin, IGF-1, and TIMP-1 by two-factor analysis of variance of log-transformed data (p < 0.05). Bars not sharing a lowercase letter are signifi- cantly different from one another (p < 0.05; Holm-Sidak’s multiple comparisons test). For all graphs, values are mean § SD. CCL2 = C-C motif chemokine ligand 2; ELISA = enzyme-linked immunosorbent assay; HF = high fat; IGF-1 = insulin-like growth factor 1; IL-1b = Interleukin-1b; IL-6 = Inter-leukin-6; TIMP-1 = tissue inhibitor of matrix metalloproteinase 1; VCAM- 1 = vascular cell adhesion molecule 1.

3.机械触觉敏感度和握力

自发性和关节损伤模型中骨性关节炎的发展与机械性异位痛和握力降低有关。他们通过计算冯弗雷纤维测试后的加权机械敏感性评分来间接评估机械性异位痛。对使用较小尺寸的细丝反应更频繁的动物会产生较低的分数。因此，分数越低或分数的减少表明机械敏感性水平越高。在24周，由于HF饮食而导致的机械敏感性没有差异(图3A).在36周时，HF饮食增加了加权反应评分（p = 0.008），而运动降低了加权反应评分（p = 0.0435）（图3A)。与24周相比，运动通过降低加权反应评分（p = 0.028），与对照组饮食小鼠的机械敏感性增加相关（图3A）。HF饮食和运动都没有改变小鼠的绝对握力(图3B).然而，当归一化为体重时，HF饮食导致握力显著降低，而不依赖于运动（p < 0.001）。（图3B)。

4.膝关节软骨和骨的OA相关及结构变化

他们通过半定量改良Mankin评分和骨赘严重程度评分来评估OA相关的关节变化。总体改良的Mankin评分（最高评分=24），整个关节的平均分没有因HF饮食或运动而改变(图4A)。此外，子成分评分包括软骨损伤（最大评分= 11）、Safranin-O染色丢失（最大评分= 8）、 tidemark duplication（最大评分= 3）和hypertrophic chondrocyte abundance（最大评分= 2），也没有因饮食或运动而改变(图4A).他们还评估了针对内侧和外侧腔室的胫骨和股骨的改良Mankin评分（最高评分= 24），饮食和运动也没有引起的差异(图4B)。HF饮食和运动并没有改变沿胫骨前内侧关节边缘的骨赘的严重程度（最高评分= 3），尽管HF饮食确实增加了运动小鼠的后内侧关节边缘的骨赘的严重程度（p =0.0094）（图4C).他们还评估了胫骨软骨下和骨小梁骨密度的结构组成的变化。在大多数地方，HF饮食和运动并没有改变骨密度。然而HF饮食（p = 0.031）和运动(p = 0）引起股骨外侧软骨下骨皮质骨密度的适度变化（HF饮食降低了密度，运动增加了密度）。与不运动的HF饮食小鼠相比，对照组运动小鼠的效果最为显著（图4D)。在胫骨近端骨小梁内观察到其他一些变化，与股骨外侧的骨密度一样， 相对骨体积(骨体积到总体积)随着HF饮食而减少（p= 0.0048），而随着运动而增加（p =0.024）（图4E)。这种效应与小梁分离的显著变化相关，而小梁分离随着HF饮食而增加（p = 0.038），并随着运动而显示出减少的趋势（p =0.06）。HF饮食也与骨小梁变薄的趋势相关（p = 0.053）（图4E)。总之，这些发现研究表明，与软骨相比，骨骼对HF饮食和运动更敏感。

5.饮食依赖的运动相关网络

轮跑通常是引起小鼠运动反应的有效方法，因为小鼠能自愿在轮子上跑很长一段距离。在这项研究中，跑轮是在小鼠25周大时提供的，这比典型的基于跑轮的运动研究年龄更大。他们观察到在对照组和HF小鼠的平均夜间跑步距离的较大差异。在跑轮被放入笼内5周后，当平均每日跑步距离最大时(图1A)，对照组小鼠夜间跑步的变化为40%，HF小鼠为55%。这种高度的变化很适合于相关网络分析。在对照组和HF运动小鼠中进行了这项分析，以评估与夜间跑步距离相关的结果。同时还评估了与跑步阶段的相关性，将其定义为在黑暗阶段发生的每天总的跑步距离的百分比。小鼠主要在黑暗期活跃，因此，跑步阶段的减少将与生物钟的中断和代谢失调有关。

图1-4中显示的所有实验终点结果作为潜在的跑步距离或相位相关的因素(即38个变量)，结果在对照组中的16个变量中≥1个显著相关，在HF小鼠中11个显著相关（不包括跑步距离和相位变量本身之间的相关性）(图5)。在两种饮食中与跑步距离或阶段相关的27个变量中，有4个变量和饮食相关：血清瘦素、胫骨内侧软骨下骨密度、胫骨骨骺小梁厚度和高营养软骨细胞丰度。在两种饮食中，瘦素与跑步距离均呈负相关。对照组小鼠和HF小鼠与软骨下骨密度与距离相呈负相关，两种饲粮的骨小梁厚度与跑步期呈负相关，与跑步距离呈正相关。另外19个与运动参数相关的变量，其中对照组12个,HF小鼠7个，表明一系列系统性和局部因素以饮食依赖的方式与运动相关。一些显著的关联包括跑步距离与血清标志物、葡萄糖耐量AUC和对照组饮食小鼠IFP大小的变化之间的负相关。此外，对照组小鼠的跑步距离与股骨外侧改良的Mankin OA评分呈正相关。在HF小鼠中，跑步距离与Safranin-O染色缺失呈负相关，值得注意的是，在HF饮食小鼠中，与跑步距离相比，运动阶段显示出更多的系统性和局部性，这些相关性表明了昼夜节律是更主要的影响因素。

6.HF饮食和运动对OA相关网络相关性的影响

他们进一步研究了不同饮食机制下运动的综合效应，使用38个局部和系统结果图1-4(图6)，为每个饮食和活动组建立一个单独的相关性网络。虽然不同组间的网络规模具有可比性，但在比较不同饮食下的不运动和运动网络之间存在显著差异。例如，运动对基于饮食的网络密度有相反的影响。在对照组中，运动密度随运动的增加而增加，从0.08增加到0.11，而在HF饮食组中，运动密度从0.12降低到0.09（图6A）。此外，特别是在运动条件下HF小鼠的正负相关的比例要大得多。

在对照组饮食小鼠中，特定的相关变量对（即“边缘"）在不运动组和运动组之间几乎不同，只有5对常见的相关变量对（图6B）。常见的成对主要是一个先验的相关变量，如Safranin-O损失评分和全关节改良的Mankin OA评分或体重和脂肪。为了更好地理解与膝关节骨性关节炎的潜在联系以及它们如何随着运动而变化，他们关注了全关节改Mankin OA评分的主要（即“第一个邻居"）网络。在不运动的对照饮食小鼠中，膝关节骨性关节炎主要与软骨损伤和Safranin-O染色丢失以及股骨外侧骨（图6）的OA评分相关。令人惊讶的是，膝关节骨性关节炎与血清瘦素、体脂、股骨内侧和胫骨软骨下骨密度呈负相关。通过运动，膝关节骨性关节炎也与体脂相关。膝关节骨性关节炎也与体重、胫骨骨小梁间距、Safranin-O染色丢失和股骨内侧骨性关节炎呈正相关。膝关节骨性关节炎与触觉敏感性退缩力和后骨赘呈负相关。尽管共同相关变量的数量大于对照组小鼠(图6C)，在HF饮食小鼠中，与在对照组饮食小鼠中一样，相关变量对在不运动组和运动组之间的差异最大。这些常见的相关因素也主要是一个先验的相关变量，如体重和体脂或软骨损伤和全膝关节骨性关节炎评分。同时他们还观察到其他的血清相关因素，包括IL-6和IGF1、IL-6和TIMP1，以及瘦素和TIMP1（均为阳性）。与对照组小鼠不同，在全关节改良的Mankin OA评分的主要“第一邻居"网络中没有系统变量(图6C)。在不运动的HF小鼠中，全膝关节骨性关节炎与所有4个部位的部位特异性OA评分相关(如： 内侧和外侧，胫骨和股骨)，这表明骨性关节炎的改变发生在整个关节。全膝关节骨性关节炎也与全关节软骨损伤、炎症重复和Safranin-O染色丢失相关。在运动型HF小鼠中，全膝关节骨性关节炎与软骨损伤、炎症重复和胫骨内侧骨性关节炎仍呈正相关。此外，膝关节骨性关节炎与前后骨赘呈正相关。因此，尽管HF不运动小鼠发生了一系列与肥胖相关的代谢病理，但与这些条件相关的变化与膝关节骨性关节炎的病理并不直接相关。

 结论：尽管在目前的测试时间内，慢性饮食诱导的肥胖和自愿轮跑对膝关节骨性关节炎病理的水平影响很小，但饮食和运动显著改变了与早期膝关节骨性关节炎相关的系统和局部变量之间的关系。这些结果表明，不同的前期OA表型可能存在于疾病的发展之前。